Beim Totenkopfaffen handelt es sich um einen Primaten, der einen schlanken und katzenähnlichen Körper besitzt. Die Weibchen sind zumeist deutlich kleiner als die Männchen, wodurch sie auch sehr viel leichter sind. Die Tiere verfügen über einen sehr langen und dünnen Schwanz, der insgesamt länger als ihr restlicher Körper werden kann. Auf ihrem rundlichen Kopf sitzen Augen. Ihre Ohren sind hell und spitz und zur Seite hinweg gestreckt.
Aufgrund der hellen Maske in seinem Gesicht, die zusammen mit seinem dunklen Maul und den dunklen Augen wie ein Totenkopf aussieht, hat sich der Name des Affen ergeben. Sein restlicher Körper ist olivgrün und orange gefärbt. Nur am Schwanz besitzt der Affe einen schwarzen Abschluss.
In freier Wildbahn leben die Tiere in den tropischen Regenwäldern von Mittel- und Südamerika. Hierbei leben sie in großen Gruppen zusammen, die bis zu 500 Tiere zählen können. Insofern handelt es sich bei den Totenkopfaffen um sehr gesellige Tiere. Bevorzugt wählen sie Bäume in der Nähe von Gewässern aus, auf denen sie sich den ganzen Tag über aufhalten. Darüber hinaus sind sie sehr geschickte und flinke Kletterer, was ihnen ermöglicht, durch die Bäume zu wandern, ohne dabei Bodenkontakt herstellen zu müssen. Obwohl sie ein festes Gebiet überschneiden, kann es vorkommen, dass sich die Wohngebiete von verschiedenen Gruppen überschneiden. Zu Kämpfen kommt es hierbei nicht.
Beim Totenkopfäffchen handelt es sich um einen Allesfresser. In erster Linie ernähren sie sich von Früchten und Insekten. Wenn es die Möglichkeit und das Nahrungsangebot zulassen, landen allerdings auch kleine Wirbeltiere, Nüsse, Knospen und Eier auf ihrem Speiseplan.
Mit einem Alter von drei Jahren werden die Weibchen geschlechtsreif, die Männchen sind zwei Jahre später dran. Die Paarung erfolgt saisonabhängig, wenn sich die Männchen während der Trockenzeit zu größeren Gruppen aus Weibchen gesellen, um eine Partnerin anzuwerben.
Die Tragzeit beträgt drei bis vier Monate, anschließend kommt ein Jungtier zur Welt. Zu dieser Zeit hat dann die Regenzeit begonnen. Die Männchen beteiligen sich nicht an der Aufzucht der Nachkommen. Die ganze Zeit über befinden sich die Jungtiere ausschließlich am Rücken des Weibchens, wo sie pausenlos umsorgt werden.
Es kann aber auch vorkommen, dass ein außenstehendes Weibchen die Betreuung kurzzeitig übernimmt, um so das Muttertier zu entlasten. Sobald das junge Totenkopfäffchen zehn Monate alt ist, wird es entwöhnt. Während die weiblichen Jungtiere zumeist mit der Mutter in einer Gruppen verbleiben, gehen Männchen eigene Wege und schließen sich einer fremden Horde an.
Ein besonderes Verhaltensmuster von Totenkopfäffchen ist, dass sie sich ihre Hände und ihr Fell mit Urin einreiben, um so einen besseren Griff beim Klettern zu haben.